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 知识产权     |      2020-02-04

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哥伦比亚大学Vagelos医师和外科医生学院的研究人员的一项新发现可以解决当前基因编辑工具(包括CRISPR)的一个主要缺点,并为基因工程和基因治疗提供了一种强有力的新方法。

CRISPR技术红得发紫,也备受诟病,其中的两大问题在于脱靶效应和效率低。近期两大顶级杂志,Science和Nature分别公布了Broad研究所张锋研究组和哥伦比亚大学Sam Sternberg研究组两项相似的研究成果:利用细菌跳跃基因,将DNA序列精确地插入基因组而不切割DNA。

12 月 18 日《自然》(Nature)杂志在线发表了一篇题为 Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR-Cas system 的新研究,来自哥伦比亚大学的科学家们利用冷冻电子显微镜捕获了一种新的基因编辑工具的首批图像

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他们的新技术称为INTEGRATE,利用细菌跳跃基因将任何DNA序列可靠地插入基因组而不切割DNA。目前的基因编辑工具依赖于切割DNA,但这些切割可能导致错误。

这两项研究克服了CRISPR技术的主要缺点,为基因工程和基因治疗提供了一种强有力的新选择。

该团队在霍乱弧菌中发现了一种独特的“跳跃基因”,其可以在不引入 DNA 断裂的情况下往基因组中插入大量的遗传有效载荷,研究人员以此开发了一个新的基因编辑工具,称为INTEGRATE。

在一项新的研究中,来自美国哥伦比亚大学的研究人员捕捉到一种由对现有的基于CRISPR的工具进行改进而产生的新型基因编辑工具的首批结构图片。他们在霍乱弧菌中发现一种独特的“跳跃基因”并且这种跳跃基因可以在基因组中插入较大的基因负荷而不引入DNA断裂,基于此,他们开发出这种称为INTEGRATE的新型基因编辑工具。相关研究结果近期发表在Nature期刊上,论文标题为“Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR–Cas system”。论文通讯作者为哥伦比亚大学瓦格洛斯内外科学院生物化学与分子生物物理学助理教授Samuel Sternberg博士和哥伦比亚哥伦比亚大学生物化学与分子生物物理学助理教授Israel Fernandez博士。

目前的工具就像分子剪刀:他们切割DNA,但实际编辑是由细胞自身的DNA修复机器完成的,哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学助理教授,新研究的资深作者Sam Sternberg博士说。你完全可以完成这项工作。今天在线发表在自然杂志上的新INTEGRATE技术更像分子胶而不是分子剪。

“跳跃基因”又叫转座子,它们无处不在,每个生命领域都携带这些DNA序列,它们利用转座酶从一个位置“跳”到另一个位置,事实上,有接近一半的人类基因组是由跳跃基因组成的。

这种全新的工具有望改进现有的 CRISPR 工具,通过冷冻电子显微镜将这种复杂的基因编辑过程冻结起来,揭示了基因编辑过程的高分辨率细节。

在这项新的研究中,这些研究人员利用低温电镜技术冻存正在发挥作用时的这种基因编辑复合物,从而揭示它的工作原理的高分辨率细节。

而不是引入DNA断裂并依赖细胞来修复断裂,INTEGRATE直接在基因组中的精确位置插入用户定义的DNA序列,这是分子生物学家几十年来一直寻求的能力,最近Sternberg说道。从加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室招募到哥伦比亚大学。

张锋研究组从蓝藻中抽提了一种转座酶,他们将其命名为CAST,即CRISPR相关转座酶。Sternberg研究组的新技术则称为INTEGRATE,利用跳跃基因将DNA序列插入基因组而不切割DNA。

“我们在研究中展示了如何利用 INTEGRATE 技术在细菌细胞中进行靶向 DNA 插入。”哥伦比亚大学瓦格洛斯学院生物化学和分子生物物理学助理教授 Sam Sternberg 博士与 Israel Fernandez 博士共同领导了这项研究,Sam Sternberg 说道,“与 Israel Fernandez 实验室这一次奇妙合作出的这些新图像,以令人难以置信的分子细节解释了这一生物过程,并将帮助我们通过蛋白质工程努力来改进该系统。”

Sternberg说,“我们在我们之前的研究中展示了如何利用INTEGRATE在细菌细胞中进行靶DNA插入。这些新的图片以令人难以置信的分子细节揭示这种基因编辑复合物的生物学机制,这有助于我们进一步改进这种基因编辑系统。”

目前的工具很挑剔

“目前的工具就像分子剪刀,切割DNA,但实际编辑是由细胞自身的DNA修复机器完成的,”Sternberg博士说。 “你是受到细胞的支配,来完成这项工作的。”

新的基因编辑工具

开始时与CRISPR一样,但是结局不同

使用当前工具编辑单元格的基因组就像使用文字处理器编辑一个巨大的文档,但使用具有自己思想的软件。通常,研究人员希望在一个特定的DNA碱基序列上做一个小的改变,使基因组的其余部分保持不变。目前最好的工具,使用来自一种细菌CRISPR-Cas系统的组件构建,以特定序列切割DNA分子的两条链,例如在一段文本中添加段落。

而新技术更像分子胶而不是分子剪刀。

现在,世界各地的许多研究人员都使用 CRISPR-Cas9 来快速、廉价地精确修改细胞的基因组。然而,CRISPR 的大多数应用都涉及要切断目标 DNA 的两条链,然后利用宿主细胞自身的修复机制将 DNA 断裂修复。

这些研究人员使用了一种称为低温电镜的技术,该技术涉及在液氮中快速冷冻这种基因编辑复合物样品,然后用电子轰击它。他们随后使用在电子显微镜下捕获的图片产生这种INTEGRATE系统的原子分辨率结构模型。

这些中断只是起点:实际的编辑是由细胞自身的DNA修复机制完成的,通常使用研究人员提供的DNA序列来填补空白。

“不用引入DNA断裂,依赖细胞来修复断裂,INTEGRATE可以直接在基因组的精确位置上插入用户定义的DNA序列,这是分子生物学家几十年来一直寻求的能力。”

控制这一修复过程仍然是该领域的一个主要挑战,因为在这个过程中常常不经意地引入不希望发生的基因编辑。此外,现有的基因编辑工具仍然难以实现以精确的方式插入大型遗传有效载荷。提高基因编辑的准确性是研究人员的首要任务,也是确保用这种技术开发疾病治疗方法的安全性的关键。

这种结构模型揭示这种基因编辑复合物由两个主要部分组成,这两个主要部分排列成螺旋丝状结构。在这两个主要部分中,较大的部分称为Cascade,缠绕并携带向导RNA,用于扫描细胞中匹配的DNA序列。一旦Cascade定位并结合了靶序列,它将使DNA链穿过位于这种基因编辑复合物末端的TniQ“转座”蛋白,并招募其他有助于修饰靶DNA序列的酶。

依靠细胞的修复机械有很大的局限性。许多细胞不正确地修复DNA断裂或在过程中引入错误,并且其他细胞甚至可能不表达插入新遗传有效载荷的必要修复机制。此外,DNA断裂引发DNA损伤反应,可能产生其他不良反应。

现有的CRISPR工具太挑剔

由 Sternberg 实验室开发的 INTEGRATE 系统,可以精确插入大的 DNA 序列,而且不需要依靠细胞机制来修复 DNA 链。因此,与目前广泛使用的传统 CRISPR-Cas 系统相比,INTEGRATE 可能被证明是一种更准确、更有效的进行某些基因修饰的方法。

INTEGRATE的这种扫描机制似乎与其他经过充分研究的CRISPR系统的工作方式相似,其中的一些CRISPR系统也含有带有gRNA的Cascade复合物。但是,与其他使用Cascade靶向DNA进行切割的CRISPR系统不同的是,INTEGRATE中Cascade的功能是靶向DNA以便基因负载的高精度插入。

这使得某些细胞类型中的基因编辑变得困难或不可能,并严重限制了研究人员以安全的方式引入精确遗传修饰的能力。INTEGRATE系统利用跳跃基因这项新工作通过一个独立的DNA编辑系统解决了这个问题

利用目前的编辑工具来修改细胞的基因组,就像是使用文字处理器编辑一个巨大的文档,而且这个软件还有自己的想法。

图 | INTEGRATE 与 DNA 结合的冷冻电镜图像

在之前的研究中,Sternberg及其同事们通过使用遗传学和生物化学提出这种CRISPR分子机器如何在功能上与转座复合物---负责基因“跳跃”的分子---存在关联,这项新的研究证实他们提出的这种观点是正确的。

  • 该系统来自霍乱弧菌 - 不需要细胞的任何帮助。

通常,研究人员希望在一个特定的DNA碱基序列上做一个小的改变,基因组的其余部分保持不变。目前最好的工具:CRISPR-Cas系统可以在特定序列切割DNA分子的两条链,就像是在一段文本中添加段落。

这种新工具还可以帮助科学家在 DNA 修复活动有限的细胞类型中实现基因编辑,因为在这类细胞中,使用 CRISPR 进行基因编辑的尝试相对不那么成功。

为何重要?

CRISPR是一类非常多样化的细菌天然防御系统。为了找到新的基因编辑工具,Sternberg和三名研究生寻找细菌,以寻找经过充分研究的CRISPR-Cas系统的变体,这些系统具有不寻常的特性,可以揭示新的工具能力。

这些断裂其实只是开头,实际的“编辑”是由细胞自身的DNA修复机制完成的,然后用研究人员提供的DNA序列来填补空白。

首次捕捉的细节

如今,世界各地的许多科学家们都在使用CRISPR-Cas9来快速低成本地对细胞基因组进行精确修饰。但是,CRISPR的大多数用途涉及切割靶DNA的两条链,然后必须通过宿主细胞自身的分子机器修复DNA断裂。控制这种修复过程仍然是这个领域中的主要挑战,并且不想要的基因编辑常常被无意间引入了基因组中。此外,现有工具在精确地插入较大的基因负荷方面通常表现不佳。提高基因编辑的准确性是人们的当务之急,这对于确保使用这种技术开发的疗法的安全性至关重要。

这种搜索使它们成为在霍乱弧菌中发现的转座子或跳跃基因。这种转座子选择了细菌的CRISPR-Cas系统,通常用于阻止移动遗传元件,将自身插入细菌基因组的不同区域。

依靠细胞的修复机械有很大的局限性。许多细胞无法正确地修复DNA断裂或在这个过程中引入错误,此外,DNA断裂还会引发DNA损伤反应,产生其它不良影响。

研究人员使用了一种获得诺贝尔奖的技术——冷冻电子显微镜,通过在液氮中快速冷冻一个基因编辑复合体样本,用电子轰击,然后他们利用电子显微镜捕捉到的图像,生成一个集成系统的原子分辨率模型

这种由Sternberg实验室开发的新型INTEGRATE系统可以准确地插入较大的DNA序列,而无需依靠细胞的分子机器来修复断裂的DNA链。因此,相比于目前广泛使用的原始CRISPR-Cas系统,INTEGRATE被证明是一种更准确、更有效的基因修饰方法。这种新工具还可以帮助科学家们在DNA修复活性有限的细胞类型中进行基因编辑。在神经元中,使用CRISPR进行基因编辑的尝试相对而言不太成功。

Sternberg和他的学生发现转座子整合到细菌基因组中的特定位点,而不是通过将DNA切割成两个,而是通过使用单独的酶将转座子滑入基因组。重要的是,酶(整合酶)插入DNA的位点完全由其相关的CRISPR系统控制。

因此,这使得某些细胞类型中的基因编辑变得困难或不可能,严重限制了研究人员安全的引入精确遗传修饰。

结构模型表明,复合材料是由两个主要部分组成的螺旋状长丝。更大的部分,称为 Cascade,环绕并携带引导 RNA,用于扫描细胞中匹配的 DNA 序列。一旦它定位并结合目标序列,就会通过位于复合物末端的 TniQ“转位”蛋白质将 DNA 链串联起来,并吸收其他有助于修饰 DNA 的酶。

下一步是什么

研究人员利用这一发现创建了一种基因编辑工具,可以编程将任何DNA序列插入细菌基因组的任何位点。与CRISPR一样,整合酶通过指导RNA找到合适的位点。

CAST系统

INTEGRATE 的扫描机制与其他研究成熟的 CRISPR 系统的工作方式相似,其中一些还包含一个带有导向 RNA 的 Cascade 复合体。然而,不像其他的 CRISPR 系统使用 Cascade 复合体来针对 DNA 进行切割,INTEGRATE 的 Cascade 功能是针对 DNA 进行高度精确的遗传有效载荷插入。

除了为未来的蛋白质工程提供信息之外,这些新结构突出了一个可能的校对检查点。现有的CRISPR技术经常出现所谓的“脱靶效应”,即不加区分地对非靶序列进行修饰。这些新结构揭示了Cascade和TniQ如何协同工作,从而确保仅将DNA片段插入到正确的 “在靶”序列中。这些研究人员计划在开发用于疾病的新治疗方法的工具时进一步探究这个检查点。

通过重新编程指导RNA,Sternberg和他的学生能够精确控制供体DNA整合的位置。通过用其他DNA有效载荷替换转座子序列,它们可以将长达10,000个碱基的序列插入细菌基因组中。因此,与其他基于整合的编辑工具不同,INTEGRATE技术是迄今为止研究的第一个完全可编程的插入系统。

张锋的CAST系统将Cas9切刻酶偶联到单链DNA转座酶TnpA上,然后在大肠杆菌基因组中检测到了这种蛋白复合物能够促进外源DNA的定点整合,这说明利用转座子可以实现基因敲入,不过单链DNA模板的制备和体内递送还存在问题。

图 | INTEGRATE 复合物的结构,Cascade、TniQ和向导 RNA

参考文献:

对编辑过的细菌进行测序证实,有效载荷是精确插入的,在非目标位置没有额外的拷贝。改进的基因编辑使用INTEGRATE,一组酶可以执行整个DNA整合过程,可靠地将任意DNA有效负载插入细胞基因组内的精确位置,而无需依赖宿主细胞的DNA修复机制。

研究人员分别测试了不同CAST基因和不同长度的tracrRNA对CAST系统的活性的影响。结果发现4种CAST基因对于外源基因整合是必需的,同时216 bp的tracrRNA足以产生外源基因的整合,并且他们还证实这种基因整合只发生一次,从而避免了多次基因插入。

如此规模的可视化生物学过程真的很神奇,甚至可以轻易地激发那些不熟悉这个领域的人。这项工作的质量和完成的速度,得益于 Sam 和 Israel 这样的厉害导师所提供的合作环境。”哥伦比亚大学欧文医学中心细胞分子和生物物理研究项目博士生、该研究第一作者 Tyler Halpin-Healy 说。

1.Tyler S. Halpin-Healy et al. Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR–Cas system. Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1849-0.

该技术应该能够提供广泛的新基因编辑机会。许多生物技术产品,包括基因和细胞疗法,工程化作物和生物制剂,需要精确整合大型遗传有效载荷。

CAST基因敲入系统不是简单的修修补补,而是从头开始设计,并从大自然进化的生物中寻求完整的解决方案,从而突破了原有系统的瓶颈,实现了基因敲入效率的跨越式提升。

在他们之前的研究中,Sternberg 和他的同事利用遗传学和生物化学提出CRISPR 机制如何在功能上与转位机制相联系,这次研究证明了他们的假设是正确的。

2.First images of an 'upgraded' CRISPR tool

INTEGRATE技术提供了一种全新的方法,具有与CRISPR-Cas9相同的可编程性和易用性,但没有与DNA断裂相关的副作用。

INTEGRATE系统

除了指导未来的工程努力方向,这些结构图像还暗示了一个可能的校对检查点。现有的 CRISPR 技术经常遭受所谓的 “脱靶效应”,在这种情况下,序列被意外修改。新的结构揭示了 Cascade 和 TniQ 如何协同工作,以确保只有正确的“目标” 序列被标记为 DNA 插入。研究人员计划进一步探索这种检查点,同时开发新的疾病治疗工具。

我们可以对这种CRISPR转座子系统进行编程,将其遗传有效载荷整合到几乎任何基因组位点,通过了解其工作原理,我们将能够将其设计为更有效,Sternberg说。

INTEGRATE系统则来自霍乱弧菌。

哥伦比亚大学已经提交了与这项工作相关的专利申请。据了解,Sam Sternberg 博士还是 Dahlia Biosciences 的联合创始人和科学顾问,也是 Dahlia Biosciences 和 Caribou Biosciences 的股东。

下一步Sternberg的团队使用细菌遗传学实验开发了INTEGRATE技术,现在他们正在测试其他细胞类型,包括哺乳动物细胞。

Sternberg等人为了找到新的基因编辑工具,搜寻细菌,找到了一个独立的DNA编辑系统,这一系统具有不寻常的特性,不需要依靠细胞的帮助。

-End-

基于CRISPR-Cas9技术的发展轨迹,Sternberg说,有充分的理由相信精确的DNA整合将在哺乳动物细胞中像在大肠杆菌中一样有效,为基础研究用途和最终的临床应用打开了大门。Sam Sternberg是哥伦比亚大学Vagelos医师和外科医生学院生物化学和分子生物物理系的助理教授。

他们发现将转座子整合到细菌基因组中的特定位点,利用单独的酶将转座子送入基因组,而不是将DNA切割成两个,即酶插入DNA的位点完全由其CRISPR系统控制。

参考:

Sanne E. Klompe,Phuc LH Vo和Tyler S. Halpin-Healy是哥伦比亚大学艺术与科学研究生院生物医学科学的博士生INTEGRATE代表通过指导RNA辅助靶向插入转座因子。这篇题为转座子编码的CRISPR-Cas系统直接RNA指导DNA整合的论文于6月12日在线发表在自然杂志上。

研究人员利用这一发现创建了一种基因编辑工具,将任何DNA序列插入细菌基因组的任何位点。与CRISPR一样,整合酶通过导向RNA找到合适的位点,精确控制供体DNA整合的位置。再通过用其它DNA有效载体替换转座子序列,将长达10,000个碱基的序列插入细菌基因组中。因此,与其它基于整合的编辑工具不同,INTEGRATE技术是迄今为止研究的第一个完全可编程的插入系统。

该研究得到了哥伦比亚大学Vagelos医师和外科医生学院院长的启动资金以及哥伦比亚大学Vagelos精准医学基金的试点资助。

研究人员在编辑过的细菌进行测序证实,INTEGRATE实现了精确插入,在非目标位置没有额外的拷贝。

改进基因编辑

这项技术能够带来广泛的新基因编辑机会。许多生物技术产品,包括基因治疗和细胞疗法,工程化作物和生物制剂,都需要精确整合。

INTEGRATE技术也提供了一种全新的方法,既有与CRISPR-Cas9相同的可编程性和易用性,又没有与DNA断裂相关的副作用。

“我们可以对这种CRISPR转座子系统进行编程,将其整合到几乎任何基因组位点,之后再通过深入了解其工作原理,我们将能够设计更有效的系统,”Sternberg说。

下一步,Sternberg的团队将检测其他细胞类型,包括哺乳动物细胞。Sternberg说,我们有充分的理由相信精确的DNA整合在哺乳动物细胞中能起到和大肠杆菌中一样的作用,为基础研究和最终的临床应用打开了新的大门。

原文标题:

Transposon-encoded CRISPR-Cas systems direct RNA-guided DNA integration,

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